close

Lita Triratna, S. Pt

Name: Lita Triratna, S. Pt

Institution:Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia

Title

Peningkatan Efisiensi Pengikatan Substrat oleh Enzim Arabinosa Isomerase dengan Metode Site-directed Mutagenesis untuk Pengembangan Agen Antidiabetes/Pangan Fungsional

Received:Rp 41,250,000.00

Proposal Summary

Tagatosa merupakan pemanis yang memiliki potensi sebagai obat antidiabetes, karena mempunyai efek mencegah hiperglisemia dan hiperinsulin. Dalam rangka industrialisasi tagatosa, enzim arabinosa isomerase (katalis isomerisasi galaktosa menjadi tagatosa) telah dipelajari secara intensif. Untuk produksi tagatosa secara ekonomis, berbagai langkah telah dilakukan untuk meningkatkan karakter enzim tersebut melalui metoda site-directed mutagenesis dan directed-evolution. Pada saat ini kami sedang mengembangkan teknik Semi Rasional Disain dengan membandingkan sekuen asam amino enzim arabinosa isomerase dari beberapa bakteri. Dengan teknik ini, kami berhasil mengidentifikasi beberapa asam amino pada posisi, 455, 456, 457, 467 dan 472, yang diprediksi bertanggungjawab terhadap nilai Km dam Kcat. Untuk membuktikan teori ini, kami akan mengonstruksi satu set mutan enzim arabinose isomerase menggunakan metode site-directed mutagenesis. Untuk membuat mutan V455I, T457A, dan A467L, PCR amplifikasi akan dilakukan dengan menggunakan gen araA dari Geobacillus stearothermophilus yang diisolasi dari Tanjung Api, Poso. Produk PCR kemudian dipotong dengan enzim restriksi Dpn1 dan ditransformasikan kedalam E.coli DH5á. Mutasi yang terjadi kemudian dicek dengan sekuensing dan klon positif ditransformasikan kedalam E.coli BL21 untuk ekspresi enzim. Ekpresi enzim ini akan diinduksi dengan IPTG. Sel hasil induksi kemudian ditambahkan Buffer Tris-HCl dan disonikasi. Setelah disentrifugasi,supernatan hasil sonikasi ini kemudian diberi perlakuan pemanasan dan disentrifus. Larutan enzim yang didapat, kemudian digunakan untuk pengujian aktivitas, determinasi protein dan parameter kinetik dari enzim.